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2024-11-23

This is Rimas's COMMONS Lab daily Open Notebook.

Today is 2024.11.23

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Literature screening methods In situ captured antibacterial action of membrane-incising peptide lamellae

  1. cette étude explore de nouvelles approches pour combattre la résistance aux antibiotiques en utilisant des peptides qui se forment en structures actives lorsqu'ils rencontrent la surface bactérienne, perturbant ainsi la membrane et tuant les bactéries, tout en étant visuellement observés via des techniques avancées https://www.nature.com/articles/s41467-024-47708-4.
  2. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review (classicmethodes) https://doi.org/10.1016/j.jpha.2015.11.005.
  3. Production of inactivated gram-positive and gram-negative species with preserved cellular morphology and integrity: une étude comparative des différentes méthodes utilisées pour inactiver des bactéries, c'est-à-dire les rendre métaboliquement mortes tout en conservant leur intégrité cellulaire. Cela signifie que les bactéries doivent être inactivées de manière à ce que leur structure cellulaire, notamment la paroi et la membrane, soit préservée, tout en minimisant la fuite de protéines et d'ADN intracellulaires. Ce type de bactéries inactivées est essentiel pour des applications spécifiques, telles que l'étude des signaux déclenchés par des récepteurs ou l’analyse des interactions bactérie-cellule qui nécessitent de longues périodes d'incubation. Bacterial inactivation with ethanol, formalin, NaOH, UV-C and BPL results in 100% inactivation efficacy. (https://doi.org/10.1016/j.mimet.2021.106208).

Protocol inscaativation:

  1. Bacterial strains and growth conditions Eight strains of bacteria from five phyla were selected as representatives for the structural differences in bacterial cell walls of Gram-positive and Gram-negative strains to evaluate the inactivation efficacy of each method (Table 1). The anaerobic bacteria Bacteroides fragilis 9343 NTBF, Parabacteroides distasonis 3999B T(B)4, Fusobacterium nucleatum patient isolate NTB17 (from the Radboudumc strain collection), Akkermansia muciniphila ATCC BAA-835 were cultured in an anaerobic jar using sachets (Thermo Fisher Scientific, USA) in Brain-Heart-Infusion (BHI) broth (Sigma-Aldrich, USA) supplemented with L-cysteine (Sigma-Aldrich, USA), yeast extract (BD, USA), hemin (Sigma-Aldrich, USA), vitamin K1 (Sigma-Aldrich, USA) for 48 h at 37 °C. Facultative aerobic strains such as Salmonella enterica serovar Typhimurium NTB6 (Kortman et al., 2014) (further designated as S. typhimurium), Streptococcus gallolyticus subsp. gallolyticus UCN34 (further designated as S. gallolyticus), Escherichia coli NC101 and Lactococcus lactis IL1403 were cultured aerobically in BHI broth overnight at 37 °C with 5% CO2.
  2. Following incubation, optical density at 620 nm was measured in the microplate reader Infinite F50 (Tecan, Switzerland) and samples were centrifuged at maximum speed (16,100 x g) for 10 min. Supernatants were discarded and OD620 was adjusted to 1.0 in 0.9% sodium chloride buffer (B Braun Melsungen AG, Germany) for treatments with BPL (Acros Organics, Thermo Fisher Scientific, USA) and pasteurization. For NaOH, ethanol (all from Merck, Germany) and formalin (formaldehyde solution about 37%, Merck, Germany) treatments, pellets were resuspended at OD620 of 1.0 in NaOH, ethanol and formalin, respectively. 2.2.2. NaOH, ethanol and formalin treatments Bacterial pellets (Table 1) were resuspended in 6 mg/ml (0.15 M) NaOH solution (Rabi et al., 2018; Vinod et al., 2014), 70% ethanol (Morton, 1950), or formalin (McDonnell and Russell, 1999), and incubated at room temperature for 5 min.(https://doi.org/10.1016/j.mimet.2021.106208).

How to proced?

  1. Culture des bactéries : • Bactéries anaérobies : Cultiver des souches comme Bacteroides fragilis, Parabacteroides distasonis, Fusobacterium nucleatum, et Akkermansia muciniphila dans une boîte à anaérobiose à 37 °C pendant 48 heures en utilisant du milieu Brain-Heart-Infusion (BHI) enrichi de L-cystéine, extrait de levure, hémine et vitamine K1. • Bactéries aérobies facultatives : Cultiver des souches comme Salmonella enterica, Streptococcus gallolyticus, Escherichia coli et Lactococcus lactis en milieu BHI à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 16-18 heures.
  2. Mesure de la densité optique : • Après incubation, mesurer la densité optique (DO) des cultures à 620 nm (OD620) à l'aide d'un lecteur de microplaque (par exemple, Tecan Infinite F50). • Centrifuger les échantillons à 16 100 x g pendant 10 minutes pour récupérer les pellets de bactéries. • Jeter les surnageants et ajuster les pellets de bactéries à OD620 = 1.0 dans une solution saline à 0.9% de NaCl (solution tampon saline, B Braun Melsungen AG).
  3. Traitement avec NaOH, éthanol ou formol : • Préparer les solutions : o NaOH : 6 mg/ml (0.15 M). o Éthanol : 70 %. o Formol : solution de formaldéhyde à 37 %. • Inactivation : o Résuspendre les pellets de bactéries dans l'une de ces solutions (NaOH, éthanol ou formol) à OD620 = 1.0. o Incuber les bactéries à température ambiante pendant 5 minutes dans ces solutions. o Cette incubation permet l'inactivation des bactéries tout en perturbant leurs fonctions métaboliques sans détruire totalement leur structure cellulaire.
  4. Étape finale : • Après l'incubation, vous pouvez procéder à des étapes supplémentaires comme la culture des bactéries traitées pour vérifier leur inactivation, ou effectuer des tests pour évaluer l'intégrité de leur paroi cellulaire (par exemple, mesure de la libération d'ADN ou coloration avec des marqueurs fluorescents). Pour préparer 200 mL de solution de NaCl à 0,9%, vous devez dissoudre 1,8 g de NaCl dans de l'eau distillée et compléter jusqu'à un volume total de 200 mL. Pour préparer 200 mL NaOH: Vous devez dissoudre 1,2 g de NaOH dans de l'eau distillée et compléter à 200 mL pour obtenir une solution à 6 mg/mL (0,15 M) de NaOH.

Notes: L’inactivation bactérienne avec de l’éthanol, du formol, du NaOH, des UV-C et du BPL donne une efficacité d’inactivation de 100 %. • La pasteurisation a entraîné une inactivation incomplète étant donné que de multiples souches bactériennes proviennent d'espèces différentes. • L’éthanol et le BPL entraînent une fuite minimale d’ADN, ce qui suggère un effet minimal sur l’intégrité cellulaire. • Le BPL et le formol ont largement maintenu l'intégrité cellulaire d' E. coli , S. gallolyticus , L. lactis et A. muciniphila .

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