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Strain

The followoing strains have been identified through their 16RNA sequencing data.

Streptomyces lusitanus

WD query for compounds https://w.wiki/BfHS #wd (Private)

More info in the related note Streptomyces lusitanus

Streptomyces xanthophaeus

WD query for compounds https://w.wiki/BfHN https://scholia.toolforge.org/taxon/Q26293525#metabolome

Paecilomyces lilacinus

WD query for compounds https://w.wiki/BfHT Not to be worked on. Human pathogen.

16S DNA sequences

S3 AAGTCGAACGATGAACCACTTCGGTGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATACTGATCGCCTTGGGCATCCTTGGTGATCGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCGCGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCACTAGGTGTGGGCGACATTCCACGTCGTCCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAACGCCCGGAGATGGGCGCCCCTTGTGGTCGGAGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCACCCTTGTCCCGTGTTGCCAGCAGGCCCTTGGGGTGCTGGGAATCACGGGAGACCGCCGGGGTCAATCGGAGGAAGGGGGG S6 ATGCAGTCGAACGATGAAGCCCTTCGGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTTCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATACCACTCCTGCCTGCATGGGCGGGGGTTGAAAGCTCCGGCGGTGAAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGATGTGAAAGCCCGAGGCTTAACCTCGGGTCTGCATTCGATACGGGCTAGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATATACCGGAAAGCATTAGAGATAGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTATACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAGGTGGGGACGACGTCAGTCATCATGCCCCTTAG

ITS Fungi sequences

CH6 AGCGGAGGGATCATTACCGAGTTATACAACTCCCAAACCCACTGTGAACCTTACCTCAGTTGCCTCGGCGGGAACGCCCCGGCCGCCTGCCCCCGCGCCGGCGCCGGACCCAGGCGCCCGCCGCAGGGACCCCAAACTCTCTTGCATTACGCCCAGCGGGCGGAATTTCTTCTCTGAGTTGCACAAGCAAAAACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAGCCCCCCCCGGGGGCCTCGGTGTTGGGGGACGGCACACCAGCCGCCCCCGAAATGCAGTGGCGACCCCGCCGCAGCCTCCCCTGCGTAGTAGCACACACCTCGCACCGGAGCGCGGAGGCGGTCACGCCGTAAAACGCCCAACTTTCTTAGAGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA

DNA Protocol extraction

PCR PROTOCOL FOR Actinomycetes DNA extraction (heat shock method):

  1. Take bacterial mycelium in a clean 1.5 mL Eppendorf tube.
  2. Grind the cells using a clean tip and suspend them thoroughly in 1 mL of distilled water.
  3. Heat the samples at 95°C in the heating block for 20 min.
  4. Transfer the tube (suddenly) to ice for 10 min.
  5. Re-heat the sample in the heating block at 95°C for 10 min.
  6. Store DNA at -20°C.

16S rDNA Primers: • 27F and 1492R 27F: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ 1492R: 5’-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3’ (A) PCR amplification in 25 μl of reaction (Accustart II): • 5 μL of genomic DNA • 0.5 μL of primer F (25 μM) • 0.5 μL of primer R (25 μM) • 12.5 μL of Accustart II PCR toughmix (2x) • 0.5 μL of gel track loading Dye (50X) • 6 μL of water

(B) PCR amplification in 25 μl of reaction (Solifast): • 5 μL of genomic DNA • 0.5 μL of primer F (25 μM) • 0.5 μL of primer R (25 μM) • 5 μL of Solifast (5x) • 14 μL of water

Amplification conditions: • Initial denaturation at 94°C for 3 min • Followed by 35 cycles of

  1. a denaturation step at 94°C for 30 s,
  2. an annealing step at 56°C for 30 s, and
  3. an extension step at 72°C for 1 min 40 s, • Followed by a final extension step at 72°C for 10 min.

Gel electrophoresis:

  1. Prepare 1% agarose: 1g agarose in 100 mL of 1X TAE buffer (40 mol/L Tris-acetate, and 1 mM EDTA, pH 8.0). (0.6 g in 60 mL for small trays)
  2. Stain the gel with 6 μl of GreenSafe solution (3 for 60 mL).
  3. Immerse the gel in 1X TAE (pH 8.0) buffer.
  4. Load the prepared PCR products into the wells.
  5. Use a 1 Kbp-DNA ladder as a molecular weight marker.
  6. Pass 100 volts of electric current through the gel for 30 min.
  7. Remove and visualize the gel, in a Trans illumination cabinet.
  8. Capture the image using a gel documentation system.

• Appearance of the target band specified for the primer set on the agarose gel is considered as a positive amplification product.

Strains picture

CH6 alt text alt text alt text

S3

alt text

S6 alt text

CH4 alt text alt text alt text V1 alt text

To do next week

1- Saturday culture bacteria 1- run LC-MS for vials soil 2- ITS extraction of CH4, CH2, V1

Saturday

Culture CH2 and CH4

Fungal DNA extraction protocol without kit

  • Protocol 1 All fungal isolates were treated with 70% ethanol and heat inactivated (100°C for 30 min). A bead beating step was added to assist with mechanical lysis of the fungal cell wall. A viability study showed that these steps resulted in no growth of a variety of diverse clinically relevant fungi, including both yeasts and molds (Supplemental Table S2). For all samples, the Qiagen (Valencia, CA, USA) EZ1 Blood and Tissue Kit as well as the EZ1 Advanced XL instrument were used (following manufacturer’s instructions) to extract genomic DNA from fungal isolates. Post extraction, DNA was quantified using Qubit 1× double-stranded DNA HS assay with the Qubit 3.0 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). DNA quantities greater than 0.04 ng/µL were considered acceptable. PCR grade water was used as a negative extraction and sequencing control. A reference strain of Candida tropicalis (CDC AR Bank 3045) was used as a sequencing positive control for each run [ doi: 10.3390/jof9020183]. Je résume:

  1. Inactivation des isolats : Tous les isolats fongiques ont été traités avec de l'éthanol à 70 % et chauffés à 100°C pendant 30 minutes pour être inactivés. Ce traitement par la chaleur et l'alcool élimine la viabilité des champignons, empêchant leur croissance, ce qui est confirmé par une étude montrant l'absence de croissance après ces étapes, même pour des champignons cliniquement importants (levures et moisissures).

  2. Lyse mécanique : Une étape de broyage avec des billes ("bead beating") est ajoutée pour aider à briser la paroi cellulaire des champignons, qui est très résistante. Cette étape facilite la libération de l'ADN contenu à l'intérieur des cellules fongiques.

  3. Extraction de l'ADN : Le kit Qiagen EZ1 Blood and Tissue et l’instrument EZ1 Advanced XL ont été utilisés pour extraire l'ADN génomique des isolats, en suivant les instructions du fabricant.

  4. Quantification de l'ADN : Après l'extraction, la quantité d'ADN est mesurée avec le test Qubit 1× double-brin d’ADN HS et le fluoromètre Qubit 3.0. Seules les quantités supérieures à 0,04 ng/µL sont considérées comme acceptables pour les analyses suivantes.

5.Contrôles de qualité : De l'eau de qualité PCR est utilisée comme contrôle négatif pour s'assurer qu'aucune contamination n'est introduite pendant l'extraction et le séquençage. Une souche de référence de Candida tropicalis (CDC AR Bank 3045) sert de contrôle positif pour vérifier la qualité et la précision de chaque séquençage.

Culture V1 in TSB for tomorrow

Sequencing platforme

Les plateformes de séquençage Illumina HiSeq, PacBio Sequel II, et Nanopore PromethION sont des technologies avancées utilisées pour le séquençage de l'ADN, mais elles se différencient en termes de méthode de séquençage, de précision, de longueur de lecture, et de coût. Voici un aperçu de chaque plateforme :

  1. Illumina HiSeq Platform Technologie de Séquençage : Illumina utilise une méthode de "séquençage par synthèse". Les brins d'ADN sont fragmentés et chaque fragment est amplifié pour former des clusters. Lors du séquençage, des bases fluorescentes sont ajoutées une à une, et chaque fluorescence est capturée par une caméra. Longueur de Lecture : Cette plateforme produit généralement des lectures de courte longueur (entre 50 et 300 paires de bases par lecture). Avantages : Haute précision et faible taux d'erreur, adaptée aux projets nécessitant une couverture profonde, comme l'exome ou le génome complet. Inconvénients : Longueur de lecture limitée, donc moins adaptée à l'assemblage de génomes complexes et à la détection de certaines variations structurelles.
  2. PacBio Sequel II Platform Technologie de Séquençage : Utilise la technologie de séquençage par observation directe d'une enzyme polymérase, appelée SMRT (Single Molecule, Real-Time sequencing). L'ADN n'est pas amplifié ; la plateforme lit directement les longues molécules d'ADN. Longueur de Lecture : Produits de très longues lectures (jusqu'à 100 000 bases), avec une longueur moyenne d’environ 10 000-30 000 bases. Avantages : Adaptée aux séquences complexes et aux longues répétitions, idéale pour l’assemblage de novo de génomes et pour détecter des variations structurelles. Inconvénients : Coût élevé par rapport aux plateformes Illumina, avec un taux d’erreur plus élevé, même s'il est réduit avec les lectures corrigées par consensus.
  3. Nanopore PromethION Platform Technologie de Séquençage : La technologie de Nanopore permet de séquencer en temps réel en faisant passer une molécule d'ADN à travers un nanopore et en mesurant les changements de courant électrique pour identifier les bases. Longueur de Lecture : Elle peut produire des lectures extrêmement longues, dépassant plusieurs centaines de milliers de bases. Avantages : Longueur de lecture quasiment illimitée et rapidité de séquençage en temps réel. Elle est portable et peut être utilisée pour des séquençages directement sur le terrain. Inconvénients : Taux d'erreur plus élevé que les autres plateformes, bien que les taux d’erreur aient diminué avec les améliorations technologiques. En résumé, le choix de la plateforme dépendra du type de projet de séquençage : Illumina pour les projets nécessitant une haute précision et une profondeur de couverture, PacBio pour des lectures longues et une bonne résolution des régions répétées, et Nanopore pour les lectures ultra-longues et les séquençages rapides en temps réel.

Lab work today

DNA extraction of CH2 and CH6, both liquid and solide culture culture V1 from the stock to avoid contamination

To do this week

Storage all active strains in glycerol 70% at -80°C.

claen your samples

Today 30-11-2024

DNA extraction and purification of CH2, CH4 and V1 Results PCR Does'n work for CH4 and V1 i have to redo extraction!

Tomorrow 31-10-24

storage of all strains redo DNA isolation of CH4 solide and liquid media

Summary of the Week (10-26-2024)

I cultivated the remaining strains CH2, CH4, and V1, and performed a DNA extraction. I successfully obtained the sequence for CH2 only. V1's DNA appeared fragmented on the agarose gel. CH4 showed no detectable DNA, likely due to its very rigid cell wall, which may have hindered the extraction process. Next week i will try other protocol for DNA extraction according to Floriane sugestions

CH2 seq

the seq was very clean means my culture is pure CH2

TCATTACAGAGTTGCAAAACTCCCCAAACCATCGTGAACGCTACCTAAACCGTTGCTTCGGCGGGCGGCGCCCTCGCGCGCCCCCCTGGGCCCGCACCGCGGGCGCCCGCCGGAGGTACACCAAACTCTTGATATGTCATGGCCACTCTGAGTCTTCTATACTGAATAAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGGATAGTATCCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCATCAAGCCCACGGCTTGTGTTGGGGACCTGCGGCTGCCCGCAGGCCCTGAAAACCAGTGGCGGGCTCGCTAGTCACACCGAGCGTAGTAGCATACGACCTCGCTCAGGGCGTGCTGCGGGTTCCAGCCGTAAAACGACCTTCGCGACCCCAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAGGACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA #NCBI (Private) BLAST alt text

Thermothelomyces guttulatus

WD query for compounds https://w.wiki/Bnes

Monday

DNA extraction of CH4 and V1

active strains storage

I stored all the active strains in 70% glycerol, each strain has 4 copies, and the tudes are at -80°C. alt text

today's review (04-11-2024)

Finaly i get bands for V1 and CH4 isolates send for sequencing all strains stored at -80°C.

Tommorow 02-11-2024

write on my lab note book wait for results sequences. clean cutures wastes analyses ITS seq of CH4 and 16S for V1.

We have sent the sequences of V1 and CH4 to sequencing, the results are not reliable, to be reextract.

results recieved 05-11-2024 CH4 CATTACCGAKTGCGGGCTGCCTCCGGGCGCCCAACCTCCCWCCCGTGACTACCTAACACTGTTGCTTCRGCGGGGAGCCCCCCAGGGGGCGAGCCGCCGGGGACCACTGAACTTCATGCCTGASAGKGATGCAGWCTGASCCTGAATACAAATCAGTCAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCRATGAAGAACGCAGCGAACTGC

L'intensité du signal de votre réaction de séquençage est très faible. Par conséquent, le résultat de votre séquençage doit être soigneusement évalué. Résultat de séquençage modéré ou ambigu. Veuillez vérifier l'état de votre réaction, qui sera mise à jour dans la zone de téléchargement dans le courant de la matinée (jours ouvrables uniquement). Economy Run (Tube) 13787654 94799985 V1 NNNNN

Today 06-11-2024

-DNA extraction of CH4 AND V1

Tomorrow 07-11-2024

PCR, agarose gel and purification.

Reviev's 07-11-2024

Children
  1. Streptomyces lusitanus